1.引言
心血管疾病（CVD）是老年人發(fā)病率高的慢性疾病，主要包括冠心病、腦血管病、高血壓、心力衰竭和風(fēng)濕性心臟病。CVD是過(guò)早死亡和生活質(zhì)量降低的主要原因，也是全球死亡的首要原因。作為心血管藥物，阿替洛爾（ATE）、美托洛爾（MET）、阿托伐他?。ˋTO）和苯扎貝特（BZB）在地表水、河流的懸浮固體和沉積物中檢測(cè)到了這些藥物，表明它們?cè)诘乇硭h(huán)境中的濃度可能更高。此類污染物可能導(dǎo)致生物體的異常生理功能。因此，有必要探討心血管藥物對(duì)可能接觸這些藥物的水生生物發(fā)育和表觀遺傳狀態(tài)的影響。
在本研究中，斑馬魚被選為模型水生生物，以研究四種心血管藥物（ATE、MET、ATO和BZB）對(duì)斑馬魚早期發(fā)育的毒性。
2.實(shí)驗(yàn)方法
根據(jù)斑馬魚早期的發(fā)育特點(diǎn)，選擇在受精后24-96小時(shí)期間每24小時(shí)觀察一次斑馬魚胚胎/幼魚。在受精后28小時(shí)，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)隨機(jī)選擇三個(gè)胚胎，通過(guò)顯微鏡記錄視頻（1分鐘），進(jìn)行自發(fā)運(yùn)動(dòng)分析，每個(gè)胚胎拍攝2-3個(gè)視頻。通過(guò)計(jì)算自發(fā)線圈收縮的頻率來(lái)確定運(yùn)動(dòng)頻率（受精后28小時(shí)）。在受精后48小時(shí)，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)隨機(jī)選擇三個(gè)胚胎，記錄15–20秒的視頻（每個(gè)胚胎2–3個(gè)視頻），以測(cè)量心率。在受精后96小時(shí)，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)隨機(jī)選擇三只幼魚來(lái)捕捉圖像，以測(cè)量身體長(zhǎng)度和眼睛大小，使用諾達(dá)思的斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)對(duì)這些視頻和圖像進(jìn)行分析。此外，孵化率在受精后48-60時(shí)期間每2小時(shí)記錄一次，表示為孵化胚胎/暴露的胚胎總數(shù)。最后，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)中隨機(jī)選擇2-3條斑馬魚（受精后120小時(shí)），利用諾達(dá)思斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)分析明暗循環(huán)下的自由泳活動(dòng)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1.四種心血管藥物對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性
3.1.1.自發(fā)運(yùn)動(dòng)和孵化
如圖1（A）所示，ATE、MET、ATO和BZB均抑制了斑魚胚胎的自發(fā)運(yùn)動(dòng)，在0.5–500μg·L-1的暴露濃度下，抑制率分別為3%–32%、2%–38%、14%–49%和15%–48%。ATO和BZB的作用強(qiáng)于ATE和MET。
如圖1（B）所示，BZB、ATO、ATE和MET以劑量依賴性的方式抑制了受精后54小時(shí)斑馬魚胚胎的孵化，在0.5–500μg·L-1的暴露濃度下，抑制率分別為10%–65%、17%–61%、4%–47%和4%–28%。
圖1
3.1.2斑馬魚胚胎的發(fā)育參數(shù)
如圖2所示，暴露于藥物的斑馬魚胚胎的死亡率與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異（<10%）。在這四種藥物中，BZB對(duì)斑馬魚幼魚的生長(zhǎng)表現(xiàn)出影響，而ATO對(duì)心率的影響最大。體長(zhǎng)的減少表明，這些藥物導(dǎo)致斑馬魚幼魚發(fā)育遲緩。暴露于ATE、MET和BZB對(duì)斑馬魚的眼睛大小沒(méi)有影響，而ATO導(dǎo)致眼睛腫脹5%-15%（圖2（D））。
圖2
表1顯示了受精后96小時(shí)觀察到的斑馬魚胚胎的典型形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明，所有藥物都會(huì)導(dǎo)致斑馬魚幼魚的異常發(fā)育，包括尾部畸形（TM）、卵黃囊水腫（YSE）、心包水腫（PE）和脊柱彎曲（BS）。在這些畸形中，YSE的發(fā)生率（0–17.3%）在所有組中最高。
表1
3.1.3自由游泳活動(dòng)
剛孵出的幼魚通常是不活動(dòng)的，或者只是偶爾以緩慢的速度短暫移動(dòng)（持續(xù)幾秒鐘）。在本研究中，進(jìn)行了60分鐘的光/暗期實(shí)驗(yàn)，以探討ATE、MET、ATO和BZB對(duì)幼魚（受精后120小時(shí)）自由游泳活動(dòng)的影響。如圖3所示，與光刺激相比，所有組中的幼魚在10分鐘的黑暗刺激下都更加活躍。在光照期間，暴露于這些藥物不會(huì)對(duì)斑馬魚幼魚的移動(dòng)距離產(chǎn)生任何顯著影響，但會(huì)改變幼魚對(duì)黑暗刺激的反應(yīng)。熄燈后，ATO、BZB、ATE和MET分別將斑馬魚幼魚的總移動(dòng)距離（10分鐘）減少了14%–63%、0–43%、0–41%和9%–33%。此外，平均速度分別降低了20%-72%、11%-62%、5%-50%和5%-36%。
圖3
3.2.BZB的表觀遺傳毒性
發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATO和BZB的毒性大于ATE和MET。一些疾病與過(guò)氧化物對(duì)表觀遺傳調(diào)控的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，本研究關(guān)注BZB對(duì)斑馬魚的潛在表觀遺傳毒性。
3.2.1.BZB的生物累積
0.5和5μg·L-1 BZB未導(dǎo)致成年斑馬魚死亡，而50和500μg·L-1 BZB實(shí)驗(yàn)組的死亡率分別為1.1%和2.2%。圖4（A）顯示了暴露于0.5、5、50和500μg·L-1 BZB 30天的斑馬魚組織中BZB的濃度。BZB在組織中的累積濃度隨著暴露濃度的增加而增加。在相同的暴露濃度下，BZB在肝臟（148–370 ng/g）中的累積濃度明顯高于腎臟（113–288 ng/g）、腸道（122–271 ng/g），鰓（110–245 ng/g）和大腦（96–236 ng/g）。作為一種脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑，BZB主要積聚在肝臟中，因?yàn)樗囚~類儲(chǔ)存脂質(zhì)和氧化脂肪酸的主要器官。如圖4（B）所示，30天凈化后，一些BZB殘留在肝臟（38–110 ng/g）、腎臟（28–80 ng/g）和大腦（18–74 ng/g）中，腸道（13–74 ng/g）和鰓（7–61 ng/g）。結(jié)果表明，BZB可以在斑馬魚的組織中長(zhǎng)期積累。
圖4
3.2.2 BZB誘導(dǎo)組織中的全局DNA甲基化
BZB對(duì)斑馬魚組織GDM水平的影響如圖5所示。BZB的暴露導(dǎo)致斑馬魚大腦、鰓、腸、肝臟和腎臟GDM水平的劑量依賴性降低。低濃度（即0.5和5μg·L-1）的BZB暴露導(dǎo)致斑馬魚大腦GDM水平下降4.3%–6.4%，鰓GDM水平降低6.1%–6.7%，腸道GDM水平減少7.1%–14.6%，肝臟GDM水平升高2.0%–12.5%，腎臟GDM水平降低5.1%–10.5%。當(dāng)暴露濃度分別為0.5和5μg·L-1時(shí)，這些組織中的GDM水平?jīng)]有顯著差異（p>0.05）。然而，當(dāng)暴露濃度分別為50和500μg·L-1時(shí)，肝臟（27.7%–38.3%）GDM水平的下降明顯大于腎臟（17.4%–31.4%）、腸道（13.7%–29.1%）、大腦（11.4%–26.7%）和鰓（13.9%–22.1%）（p<0.05）。
圖5
3.2.3.BZB誘導(dǎo)的肝臟基因表達(dá)
如圖6所示，肝臟中PPARα、Dnmt1和p53的表達(dá)隨著暴露濃度的增加而上調(diào)。與對(duì)照組相比，暴露于50和500μg·L-1的BZB分別將PPARα的表達(dá)上調(diào)2.3倍和7.6倍，而低暴露濃度（0.5和5μg·L-1）不會(huì)造成任何顯著影響。與對(duì)照組相比，暴露于50和500μg·L-1的BZB分別導(dǎo)致Dnmt1表達(dá)增加1.8倍和3.5倍，而低暴露濃度未造成顯著影響。此外，暴露于5–500μg·L-1 BZB可將p53的表達(dá)上調(diào)2.9至4.8倍，而0.5μg·L-1 BZC則無(wú)明顯影響。長(zhǎng)期暴露于較高濃度（50–500μg·L-1）的BZB可能會(huì)導(dǎo)致斑馬魚有肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
圖6
4.結(jié)論
對(duì)于四種藥物阿替洛爾（ATE）、美托洛爾（MET）、阿托伐他?。ˋTO）和苯扎貝特（BZB）的研究結(jié)果表明，這些藥物均導(dǎo)致斑魚胚胎自發(fā)運(yùn)動(dòng)減少和孵化延遲，阿托伐他?。ˋTO）和苯扎貝特（BZB）的抑制作用比阿替洛爾（ATE）和美托洛爾（MET）更強(qiáng)。藥物暴露會(huì)對(duì)斑馬魚幼魚造成亞致死毒性影響，如孵化率、體長(zhǎng)和心率降低，阿托伐他汀（ATO）還導(dǎo)致幼魚眼睛腫脹5%-15%。在接觸藥物的幼魚中觀察到卵黃囊水腫、心包水腫、脊柱彎曲和尾部畸形，卵黃囊水腫是最常見的畸形。此外，藥物可以抑制自發(fā)運(yùn)動(dòng)和自由游泳活動(dòng)。在暴露于0.5μg·L-1至500μg·L-1 苯扎貝特（BZB）的成年斑馬魚（4個(gè)月大）的肝臟、腎臟、腸道、鰓和大腦中觀察到苯扎貝特（BZB）的積累和全局DNA甲基化水平的降低。肝臟是苯扎貝特（BZB）積累和DNA低甲基化發(fā)生的主要器官。在肝臟中，還觀察到與脂質(zhì)代謝（PPARα）、DNA甲基化（Dnmt1）和凋亡（p53）相關(guān)的基因過(guò)度表達(dá)。目前的研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期接觸低濃度的心血管藥物可能會(huì)對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重威脅。
參考文獻(xiàn)
Ping, S., Lin, W., Ming, R., He, Y., Yin, Y., & Ren, Y. (2022). Toxic effects of four cardiovascular drugs on the development and epigenetics of zebrafish (Danio rerio). Science of the Total Environment, 846, 157360.
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